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　　来自广州医科大学广州霍夫曼免疫研究所等处的学者以果蝇基因敲除为主线,系统阐述了果蝇基因组编辑技术的演化,着重论述了基因打靶、ZFN(Zinc-finger nucleases)、TALEN(Transcription activator-like effector nucleases)及CRISPR/Cas9技术的发展和应用。

        黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)是研究生命科学的重要模式动物,基因组编辑技术的发展有助于人们更好地利用果蝇来进行遗传学、发育生物学、生物医学等领域的研究。从20世纪开始,果蝇基因组编辑技术经历了从随机突变到精确敲除、从单纯的基因突变体制作到多样化的基因组精确编辑的过程。甲基磺酸乙酯(Ethyl methanesulfonate, EMS)化学诱变是利用正向遗传学研究基因功能的重要手段,但是无法实现果蝇基因的精确敲除。

        基于同源重组建立的基因打靶技术首次实现对果蝇基因组任意位点的精确编辑,但效率较低。CRISPR/Cas9(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein)系统介导的果蝇基因组精确编辑相对于基因打靶技术具有简单、快速、高效的特点。近期来自广州医科大学广州霍夫曼免疫研究所等处的学者以果蝇基因敲除为主线,系统阐述了果蝇基因组编辑技术的演化,着重论述了基因打靶、ZFN(Zinc-finger nucleases)、TALEN(Transcription activator-like effector nucleases)及CRISPR/Cas9技术的发展和应用。

        基因组编辑是现代分子生物学研究的重要课题，也是基因表达调控、基因功能、药物开发、基因治疗等一系列研究的前提。果蝇基因组编辑技术，特别是突变体获得技术也经历了一系列的发展演化。20世纪20年代，Morgan的学生Muller应用X射线造成基因组损伤使染色体重排，大大提高了果蝇基因突变的频率。过去几十年，传统的果蝇突变体制作方法的应用，如化学诱变、转座子介导的突变等，在一定程度上促进了以果蝇为模型的现代生物学研究。

       1968年，Lewis和Bacher利用甲基磺酸乙酯(Ethyl methanesulfonate, EMS)处理构建了第一个果蝇化学诱变突变体。然而，由于EMS诱导产生的点突变筛选困难，大量序列比对和杂交工作费时费力，EMS化学诱变的方法并未在果蝇突变体获得过程中得到广泛应用[5]。直到20世纪80年代，转座子插入(Insertion)/跳跃(Jump-out)的方法成为基因突变的有力工具。Cooley等利用转座子插入的方法获得1300个单个P因子插入的果蝇品系并用于隐性突变体的大规模筛选。2000年，Rong等建立的基于同源重组的基因打靶(Homologous recombination mediated gene targeting)技术首次实现果蝇基因的精确敲除。

       近年来，ZFN(Zinc-finger nucleases)、TALEN(Transcription activator-like effector nucleases)及CRISPR/Cas9(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein)技术的应用，极大丰富和简化了果蝇基因组编辑的手段。

        ZFN、TALEN及CRISPR/Cas9介导的基因组精确编辑依赖于细胞DNA双链断裂(Double strand break, DSB)的形成及随后的DNA损伤修复机制来实现。三者以不同的方式，造成目的基因靶序列的DNA形成DSB。在真核生物细胞中，DSB修复主要以两种方式进行：非同源末端连接(Non-homologous end joining,NHEJ)和同源重组(Homologous recombination, HR)。

        NHEJ是一种快速、低精确度的DNA损伤修复方式，通过该方式进行的DSB修复通常伴随核苷酸碱基的增加、缺失或者替代，从而造成目的基因的移码突变。HR修复方式则利用同源序列作为模板对DSB进行精确修复。利用此原理，在目的基因断裂产生DSB的同时导入外源的特定DNA序列作为修复模板，可以实现目的基因的精确编辑。

        与基因敲除相对应，RNA 干扰(RNA interference, RNAi)是另外一种在果蝇功能基因组研究过程中被广泛采用的技术。RNAi利用Dicer核糖核酸酶作用产生dsRNA(Double-stranded RNA)与目的mRNA配对，促使其降解，从而沉默特定基因的表达。RNAi不涉及DNA的改变。将RNAi与Gal4/UAS系统结合可以实现在果蝇全身或特定组织中的目的基因沉默。基于此，RNAi被广泛应用于果蝇大规模基因组筛选的研究。RNAi的不足之处表现在：(1)容易产生脱靶效应；(2)目的基因被敲低而并非敲除。

       作者指出，果蝇作为经典的模式生物，应用于生命科学研究已有100多年的历史。经过一个多世纪的发展，果蝇遗传学工具得到了极大丰富，果蝇基因组测序也已完成。但果蝇的秘密，特别是基因组/蛋白质组的秘密，人们远未探究清楚。

       在过去80年，准确地说在ZFN出现之前，要解开果蝇基因组之谜异常困难，因为获得单个基因的突变体尚需要投入大量精力，更不用说结构复杂的基因家族、基因簇、非编码RNA的研究。直到ZFN、TALEN、CRISPR/Cas9技术的诞生，使之成为可能。利用这些技术，人们能够实现对果蝇基因组进行多种精确的编辑，包括：(1)在果蝇未知功能的基因后插入标记基因从而研究该基因的表达模式和功能，而无需担忧抗体制备的困难；(2)对于成簇排列的基因家族、冗余功能的基因、非编码RNA基因等，可以通过大片段敲除进行研究；(3)对于结构和功能复杂的蛋白，可以结合HR制备蛋白特定功能域缺陷的突变体，实现对基因不同功能域的解析；(4)研究果蝇重要信号通路，如Notch、Hippo通路中多因子相互作用，可以方便地同时制备多基因突变体果蝇，避免之前复杂的杂交、重组过程；(5)利用CRISPR/Cas9进行大规模的基因敲除，建立果蝇突变体库。

       果蝇的遗传学优势体现在便于大规模遗传学筛选，但其前提是存在可用于筛选的基因突变体库(或者RNAi品系库)。之前，由于大规模制造果蝇突变体困难，国际上仅存果蝇RNAi品系库，如VDRC和NIG。VDRC自2007年建立以来，目前包含约13 000个蛋白编码基因共约27 000个RNAi果蝇品系。VDRC的建立促进了果蝇功能基因组学的研究，但是RNAi技术的先天不足(脱靶效应以及基因的敲低而并非完全敲除)一定程度上限制了其更加深入的研究应用。CRISPR/Cas9技术制作果蝇突变体效率高。通过一次显微注射针对多个基因的sgRNA，可以实现一次敲除多个目的基因。2014年10月，中国科学家宣布利用CRISPR/Cas9基因敲除技术完成斑马鱼1号染色体上共1333个基因的敲除。果蝇相对于斑马鱼基因操作更简单，我们有理由相信，利用CRISPR/Cas9进行果蝇大规模的基因敲除，最终建立果蝇全基因组突变体库是值得期待的。