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NgAgo是否能取代CRISPR?

来源/作者:Genelibs   发表时间:2016-06-20 08:54:55  
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  如今,生物学家又多了一种基因编辑蛋白的选择 – 来自格氏嗜盐碱杆菌(Natronobacterium gregoryi)的Argonaute蛋白,简称NgAgo。不过,问题来了:NgAgo是否能取代CRISPR?这当然不会在一夜之间发生,不过也许 有几个理由让你选择NgAgo,而不是Cas9或Cpf1。

       NgAgo-gDNA技术是以DNA作为引导工具的基因编辑技术NgAgo-gDNA技术的工作原理与CRISPR-Cas9技术有些类似,都是在引导工 具的引导下,令核酸酶对特定位点的基因序列进行切割,从而进行基因编辑。不同的是NgAgo-gDNA技术中所用到的引导工具是一段引导 DNA(gDNA)而不是CRISPR-Cas9技术中的RNA。由于也不需要通过蛋白(如锌指蛋白)来寻找需要替换的序列,因此,NgAgo-gDNA 技术与CRISPR-Cas9技术一样,较之前的基因编辑技术,在操作上要简单方便得多,利于其在应用中的推广。

      在真核生物中,Argonaute蛋白在RNA干扰中发挥重要作用,与向导RNA结合切割外源RNA。 Argonaute蛋白也存在于原核生物中,一些蛋白抵御入侵的DNA。2014年,Swarts等人从嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)中鉴定出Argonaute(TtAgo),表明此蛋白能在磷酸化DNA的指导下,在体外切割DNA。不幸的是,Swarts 等人未能在哺乳动物细胞中实现TtAgo介导的切割,这可能是由于温度要求高。

     为了解决这个问题,河北科技大学韩春雨教授领导的研究小组搜索了Argonaute的同源蛋白。他们鉴定出 NgAgo,并发现它能够切割多个哺乳动物细胞系中的质粒和基因组DNA,其效率与Cas9相似。与Cas9一样,当模板存在时,NgAgo还能够介导同 源定向修复。

      Cas9 vs. NgAgo与Cas9相比,NgAgo有一些独特的功能。这些包括:

      更高的靶向灵活性:与Cas9及其他CRISPR酶不同,NgAgo不需要PAM序列,因此用户在选择基因组目标上有着更高的灵活性。在富含GC的区域上,NgAgo的表现似乎比Cas9更为出色。

      采用DNA向导:NgAgo采用5’磷酸化的DNA向导(称为gDNA),而不是Cas9或Cpf1所采用 的RNA向导。这些24个碱基的DNA向导可能更加好用,因为可作为寡核苷酸订购,在细胞中保持稳定。gDNA也需要转染到感兴趣的细胞中。相比之 下,RNA向导必须通过质粒表达或体外转录,而gRNA二级结构的改变可能影响编辑效率。研究人员在检验NgAgo是否偏爱某些向导序列时,以10个基因 为对象,每个采用5条向导,没有发现切割效率有差异。如果这个结果可以在更大的研究中重复,那么这相对Cas9很有优势。

      体积更小:NgAgo的长度只有887个氨基酸,比其他基因编辑蛋白更短,如SpCas9(1368 个氨基酸)、SaCas9(1053个氨基酸)或Cpf1(1228或1307个氨基酸)。当你使用容量小的病毒载体(如AAV)时,这一点很有优势。

      碱基去除:以RNA为向导的CRISPR酶引起双链断裂,带来平端(Cas9)或交错(Cpf1)切割。 NgAgo采用不同的方法,从gDNA指定的切割位点上随机去除1-20个核苷酸。这可能有利,也可能不利,具体取决于你的应用。在天然状况下,人们推测 这种碱基去除能防止入侵的基因组再次恢复原样。如果你希望破坏基因功能,那么这种性质可能具有优势。不过,碱基切除后的修复可能改变目标序列,降低同源定 向修复的效率。

      脱靶效应:目前还需要更多的研究来比较CRISPR和NgAgo,不过NgAgo似乎有着更低的脱靶效应。在韩春雨教授的实验中,DNA向导中任一位置的单个错配都会影响NgAgo的活性,而三个错配则完全破坏活性。

      向导忠诚度:NgAgo的向导掺入似乎仅限于蛋白合成的时期,因此NgAgo只对它的向导DNA忠诚,不能转换向导。尽管这种保真性可防止其他细胞核DNA与NgAgo结合,但似乎很难让NgAgo破坏多个目标。

      在人们为这一研究成果喝彩的同时,也有人认为,大家不能高兴得太早。在Addgene的博文下面,有人评论道:“是否有人担心gDNA会随机掺入待修饰细胞的基因组中?” 的确,对于新的NgAgo,我们还有许多工作要做。不仅要掌握其带给我们的在生物技术中的研究方便性,更重要的是知道NgAgo能给细胞带来哪些“副作用”,虽然“副作用”

有时避免不了,也应争取降低到最小。


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