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近年来，非编码RNA研究领域中百花齐放，精彩纷呈。circRNA作为该领域中的新宠自是当仁不让，从NCBI有关于circRNA发表文献来说，一直处于一个持续上升的趋势（下图1）。很多热情高涨的小伙伴们都欲对其一探究竟，却又苦于不知从何下手而着急万分，那么本文则帮助大家更快更好的在circRNA领域占得一席之地。

circRNA的筛选及验证

显然，到目前为止，circRNA研究领域仍是一个充满了潜力的大宝库。每一个研究领域、研究方向都有发现新的circRNA功能的可能性。因而首先要从你的研究方向入手，找到属于你的circRNA。一般通过高通量的检测手段（芯片或测序），即可筛选到成百上千个在某种特定条件下与疾病特异性表达相关的circRNA。同样，高通量筛选的circRNA验证也是必不可少。

然而，circRNA的RT-PCR验证有其特别之处。常规PCR引物只针对目的片段的上下游进行设计，而circRNA引物可分以下两种方式设计：1）外显子环化circRNA，需要特异性针对剪切位点处（backsplice junction site)来设计primer；2）内含子环化circRNA，可跨剪切位点设计，也可围绕内含子区域设计引物。另外，circRNA引物设计建议还需要满足扩增产物长度不超过100bp；且内参基因不能选用线性mRNA，可采用外参弥补。

circRNA功能验证

通常只要是你所在研究领域还没有circRNA发表文章，那么鉴定到与疾病表达相关特异性的circRNA，并稍加以验证，1~3分的文章还是可以的。如果再想把文章档次往上提一提，发表3-5分的文章的话，则需要用体内体外实验去验证circRNA的功能。

circRNA表达的组织特异性验证

此时，可用原位杂交技术（Situ Hybridization）进行验证。设计杂交探针时要跨backsplice junction位点，而后可很清楚的看到circRNA在哪些组织中表达很高，作为组织特性判断的依据。

正向验证——circRNA过表达

目前比较公认的成环机制为circRNA侧翼序列的碱基互补配对，称之为Alu结构。基于此，可用PCR扩增含侧翼Alu序列的目标DNA序列，而后依据相应限制性内切酶位点进行酶切，连接至pEGFP-C1载体中。将连接载体转染相应细胞样本，定量PCR检测转染效率。最后用divergent primer验证circRNA过表达倍数。

过表达策略：1. 扩增目标区域包含circRNA侧翼Alu序列或内部碱基互补序列，侧翼上下游1kb处过表达效率更佳；2. 目标区域扩增基于基因组DNA为模版。

反向验证——circRNA沉默

沉默circRNA，可用siRNA沉默，即针对circRNA 的backsplice junction位点前后序列设计siRNA；而对于内含子环化circRNA，还可针对内含子区域设计相应siRNA。最后利用Divergent primer验证circRNA敲除倍数。此外，每个siRNA设计相应的对照（backsplice junction位点一端互补配对，另一端错配)。

circRNA机制研究

目前针对circRNA的功能机制研究不多，常见的调控基因表达和蛋白合成方式有：1）circRNA能与蛋白质/RNA结合,募集蛋白质复合体的组分或调控基因的表达；2)circRNA可以作为“sponge”海绵吸miRNA，调节靶基因；3）circRNA通过碱基互补配对直接调控其他RNA水平。

一般来说，ceRNA调控机制是circRNA作用机制研究的首选，因而很多文章优先从ceRNA的角度去解释其作用机理。而circRNA作为miRNA的“sponge”有两个基本前提：1）circRNA和mRNA有共同的miRNA结合位点。2）circRNA影响其竞争结合对象mRNA的表达。

首先用RNA-FISH确认circRNA在细胞中的定位。细胞定位是决定调控机制研究方向的关键。转录后调控尤其是ceRNA调控，一般认为在细胞质中进行，如果该circRNA主要定位于细胞质，那么是有可能成为ceRNA分子的。

其次，寻找靶定circRNA的miRNA及miRNA靶定的mRNA。1）利用生物信息学对其进行预测，即通过miRcode/starBase筛选circRNA潜在的miRNA结合位点（MRE），同时通过miRTarBase预测miRNA的靶基因。而后用通过荧光素酶报告系统及免疫共沉淀（RIP）进行验证circRNA和mRNA之间的表达呈正相关性。2）也可直接通过circRNA+mRNA组合芯片高通量筛选，分析差异表达circRNA和mRNA之间的表达相关性分析，寻找与circRNA关系密切的mRNAs

最后，验证circRNA对miRNA及其下游靶基因的表达影响。这部分可通过过表达和沉默circRNA中检测mRNA的变化，过表达和沉默mRNA来检测circRNA的变化以及circRNA和mRNA表达相关性分析加以验证。

举个例子：

1）在细胞中转染miRNA mimics，检测circRNA和突变circRNA的靶基因表达变化。

2）在circRNA敲除细胞系，抑制miRNA的表达；或在circRNA过表达细胞系中，异位表达miRNA，检测能否抵消掉circRNA异常表达引起的生物学变化。

3）构建含有靶基因mRNA 3’UTR区和突变序列的载体，检测在circRNA敲降条件下是否会降低，加以在miRNA sponge的条件下，又是否能够补救；或者在circRNA过表达下，mRNA表达是否会升高，加以miRNA过表达时又是否能够补救。

如此将circRNA研究提升到作用机制的层次，后续在体内做些工作加以验证的话，那么，5分以上甚至10分以上的文章还是很有希望的。