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　　最开始，CRISPR-Cas基因组编辑技术很大程度上依赖于化脓性链球菌Cas9 (SpCas9)，但这种Cas9相对来说“个头”比较大，会阻碍病毒传递和细胞表达。这项技术工具的最新升级改造，通过改进Cas9酶和重编程新酶，研究人员能获得更加适合不同基因组编辑应用的新工具。

      基于原核 CRISPR-Cas 免疫系统的基因组编辑技术是近几十年来最强大的生物学技术突破之一，这种工具能对许多种类的生物进行精确的遗传改变，为基础研究，生物技术和临床医学带来了巨大的希望。

     这种技术工具的最新升级改造，通过改进Cas9酶和重编程新酶，研究人员能获得更加适合不同基因组编辑应用的新工具，这也加速了其在临床上的应用。Cas9 是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御，可用来对抗入侵的病毒及外源DNA。

      应该说CRISPR-Cas系统是继Meganuclease、锌指酶和TALEN之后，又一通过各自的DNA结合域来靶向目的序列，不过这一技术 使用RNA为核酸酶导航，不仅很容易设计，而且能够改写几乎任何基因组序列。但是这并不是说CRISPR-Cas就没有自己的局限性了，不过幸运的是，不 少研究人员取得了显著进展，优化了 Cas9，提高了这一技术的灵活性、保真性和精度。

      最开始，CRISPR-Cas基因组编辑技术很大程度上依赖于化脓性链球菌Cas9 (SpCas9)，但这种Cas9相对来说比较大，会阻碍病毒传递和细胞表达。2015年两个研究组发现了两个更小一些的Cas9同源物，即来自金黄色葡萄球菌和嗜热链球菌中的Cas9，这令真核系统进一步编辑更为高效。

      SpCas9识别的是任何核苷酸后面的两个鸟嘌呤DNA碱基PAM序列。这将SpCas9靶向的PAM序列局限为必须包含两个连续鸟嘌呤的DNA序列。为 了解决这一问题，麻省总医院研究小组建立了一个工程系统，使得他们能够快速地演化SpCas9识别不同PAM序列的能力。通过收集随机突变的SpCas9 变体，他们鉴别出了使得SpCas9能够新PAM序列的突变组合。这些演化变体基本上让SpCas9可以进行靶向基因编辑的位点范围扩大了一倍。

      CRISPR-Cas系统另一个重要的改进就是减少脱靶效应，这对于临床应用尤为重要。目前已经报道了多种增加Cas9 特异性的方法，其中最显著的是由张锋和Keith Joung领导完成的一项成果：随后任意组合改变1条、2条、3条或4条氨基酸侧链，测试了总共15种可能的变异体，发现了一种三个位点发生替代的变异 体：SpCas9-HF1（SP代表化脓链球菌，是这一广泛使用的Cas9的来源，HF代表高保真），相比于未改变的原始SpCas9，在研究人员测试的 37种不同的导向RNAs中，这一变异体采用85%的导向RNAs诱导出了靶向效应。

       除了SpCas9-HF1，这组研究人员还发现三个氨基酸突变可大大减少“脱靶”切割。利用测试的导向RNAs，他们证实“脱靶”切割已降低至检测不到的水平。研究小组将这种新设计的酶命名为“增强型”化脓性链球菌Cas9（ eSpCas9 ），可用于需要高水平特异性的基因组编辑应用。

       然而，对于基因组编辑来说最大的挑战也许应该是DNA序列精确替换的相对低效率。DNA序列精确替换并非简单替换那么简单 ，DNA序列是 使用一串字母表示的真实的或者假设的携带基因信息的DNA分子的一级结构。基因组编辑若想提高DNA序列精确替换的效率还需要再研究研究。