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　　以RNA干扰为基础的遗传筛选已经实现了人类细胞全基因组范围筛选，但是由于对 RNAi 生物学的不完整解析，以及由此产生的数据，导致了一些错误的分析……

       自2012年底CRISPR/Cas9最初被用于基因编辑之后，这个前途光明的技术已经被应用到了许多研究领域，而且随着技术的改良，越来越多的研 究团队利用CRISPR进行大规模的遗传筛选，比如用于识别导致癌症抵抗治疗的突变，或者加速药物靶标评估。RNA干扰，相比于CRISPR/Cas9 在遗传筛选方面的作用，无论是效率和特异性方面，目前都难以望其项背了。

    人类细胞系遗传筛选寻找癌症靶向

      以RNA干扰为基础的遗传筛选已经实现了人类细胞全基因组范围筛选，但是由于对 RNAi 生物学的不完整解析，以及由此产生的数据，导致了一些错误的分析。 2013年，两篇人类细胞CRISPR-Cas9敲除筛选研究成果，一篇发现靶向18,080个基因（64,751个独特靶向序 列）的全基因组范围CRISPR-Cas9敲除（GeCKO）文库慢病毒传递，能进行在人类细胞中的正向和负向选择性筛选；另外一篇通过CRISPR技 术，鉴定出允许黑色素瘤细胞增殖的基因和让它们对某些化疗药物产生耐受性的基因。

       RNAi 的不足之处在于它靶向 mRNA 而不是 DNA，因此它不可 能100% 剔除基因。张锋之前曾表示，“CRISPR 能够完全地剔除细胞中的一种给定蛋白，而shRNA(短发夹RNA) 只是降低它的表达水平，但是从不会达到完全剔除。”

       来自加拿大多伦多大学Jason Moffat实验室的Traver Hart也是一位CRISPR技术领域的青年科学家，他曾自己定义了一套用于评估RNAi和CRISPR遗传筛选治疗的金标准，并且利用HCT116细胞系（来自人类结肠癌），Hart发现CRISPR筛选不仅更加敏感，也能避免出现额外的背景错误。

        相比于RNAi筛选，CRISPR筛选具有哪些优势呢？CRISPR 筛选是通过“整个生物学意义基因表达（水平）进行筛选，而shRNA似乎只能在非常高水平表达的基因中进行筛选，”Hart说，“这些信息我们无法从 shRNA数据中获取，除非我们能更好比对它，所以我们无法得知那些不知道的信息，而CRISPR技术，我们确信它将会革新遗传筛选领域。”

      Hart研究组去年发表文章，逐个关闭了近1.8万个基因（整个人类基因组的90%）来寻找对细胞生存至关重要的基因。由此Hart生成了多伦多敲除文库（Toronto KnockOut (TKO) library），靶向17,661个人类蛋白编码基因的慢病毒编码导向RNAs二代文库。Hart说，“这个数字对于任何进行shRNA或者RNAi研究的人来说都十分惊人（后者一般只能获取几百个数据）”。

       12年前的人类基因组测序让科学家们编写出了构成我们细胞和身体的部件——我们2万个基因的清单。尽管取得了这一重大的成果，我们仍然不清楚每个基因的功 能，或当一些基因出错时让我们生病的机制。为了做到这一点，科学家们意识到必须要逐个去关闭整个基因组中的基因，以确定细胞中哪些过程出现了错误。但可以 利用的工具不是不准确就是太慢。

       CRISPR的出现使得快速及高精度关闭基因变为可能，而且这项研究也通过在5种不同的癌细胞系，包括脑癌、视网膜癌、卵巢癌和2种大肠癌细胞中关闭一些 基因，发现了每种肿瘤都依赖于一组独特的基因，可以用一些特异性药物来靶向它们。这一研究发现为设计出只靶向癌细胞，而不损伤周围健康组织的新疗法带来了 希望。  CRISPR现在正在应用于治疗各种癌症方面，在治疗癌症的新疗法中做出了巨大贡献。

参考文献：

Use and Abuse of RNAi to Study Mammalian Gene Function

Measuring error rates in genomic perturbation screens: gold standards for human functional genomics

Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells

Genetic screens in human cells using the CRISPR-Cas9 system

High-Resolution CRISPR Screens Reveal Fitness Genes and