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张锋Cell发表CRISPR研究新成果

来源/作者:alax   发表时间:2016-04-25 14:37:09  
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  来自Broad研究所、东京大学的研究人员,在新研究中揭示出了Cpf1/向导RNA/靶DNA复合物的晶体结构。这一重要的研究成果发布在4月21日的《细胞》(Cell)杂志上。

 

来自Broad研究所、东京大学的研究人员,在新研究中揭示出了Cpf1/向导RNA/靶DNA复合物的晶体结构。这一重要的研究成果发布在4月21日的《细胞》(Cell)杂志上。

Broad研究所核心成员张锋(Feng Zhang)博士及东京大学医学科学研究所基础医学系Osamu Nureki教授是这篇论文的共同通讯作者。张锋博士是近几年大热的CRISPR/Cas9技术的先驱开创者之一。2013年,这位80后的年轻华人科学家开发出了可用来编辑DNA、敲除指定基因的CRISPR/Cas系统,自此之后一直致力于推动这一技术走向完美。

2014年2月,张锋曾与Nureki教授联手合作生成了CRISPR/Cas系统关键组成部分——Cas9复合体的第一张高分辨率图像。这一重要的研究成果发布在Cell杂志上,有望帮助研究人员改良及进一步操控这一工具加速基因组研究,使得这一技术更加接近应用于人类遗传疾病治疗。

微生物适应性免疫系统CRISPR-Cas帮助了细菌和古细菌保护自身抵御外源核酸的入侵。CRISPR-Cas系统包含一系列重复序列,中间被来自外源DNA的独特间隔序列隔开。这些串联重复序列转录为长转录物(CRISPR RNAs前体),随后加工生成小CRISPR RNAs (crRNAs)。crRNAs可与Cas核酸内切酶(某些情况下与辅助Cas蛋白)形成复合物,充当向导靶向及切割同源的外源核酸,由此实现干扰。在靶位点的附近存在一段前间区序列邻近基序(PAM)是Cas-crRNA复合物识别DNA的必要条件,其促成了自我与非自我识别。

多种多样的CRISPR-Cas系统根据干扰模块的体系结构被广泛分为两类:1类系统利用了由几个Cas蛋白构成的一种复合物,2类系统则利用的是单一酶,如Cas9。Cas9是一种双RNA引导的核酸内切酶,能够识别、结合及切割靶DNA,它已被利用来构建精确的基因组工程工具。在初步证实了利用Cas9编辑哺乳动物基因组的可行性后,研究者们在短期内开展了大量的研究工作进一步改造这一核酸内切酶来实现从高通量功能获得性筛查到靶向性调节组蛋白标记等广泛的应用。

在2015年发表于Cell杂志上的一项研究中,哈佛-麻省理工Broad研究所的张锋及其同事们报告称发现了一种不同的CRISPR系统:CRISPR–Cpf1,其有潜力实现更简单、更精确的基因组工程操作。他们描述了这一新系统一些出乎意外的生物学特征,证实可以操控它来编辑人类细胞基因组。与Cas9相似,Cpf1可以被重编程通过与向导RNA的互补性来靶向DNA位点。但Cpf1具有一些不同于Cas9的独特特征,有可能大大扩充基因组编辑的工具箱。

为了阐明Cpf1识别和切割靶DNA的机制,在这篇Cell文章中研究人员报告称确定了氨基酸球菌属(Acidaminococcus sp)Cpf1 (AsCpf1)与向导RNA和靶DNA复合物的晶体结构,分辨率达到2.8 埃(Å)。AsCpf1采用了一种二裂片(bilobed)结构,RNA-DNA异源双链核酸分子束缚在中间通道内。他们通过比较AsCpf1和Cas9的结构,揭示出一些惊人的相似性和主要的差异,由此解释了它们独特的功能。AsCpf1包含RuvC结构域和一个推定的新核酸酶结构域,它们分别负责切割非靶向及靶向DNA链,由此生成交错的DNA双链断裂。AsCpf1借助了一些碱基和形状读取机制来识别5′-TTTN-3′PAM。

这些研究结果提供了有关RNA引导Cpf1切割DNA机制的一些新见解,为合理设计建造CRISPR-Cpf1工具箱建立了一个框架。

此外,在4月20日的Nature杂志上,来自哈尔滨工业大学、清华大学的研究人员报告称,他们获得了Cpf1/CRISPR RNA复合物的晶体结构。领导这一研究的是哈尔滨工业大学生命科学与技术学院的黄志伟教授。这篇文章揭示出了crRNA的识别机制,提供了crRNA引导LbCpf1底物结合的一些新见解,为设计改造LbCpf1提高基因编辑的效率和特异性建立了一个框架。

 

推荐原文摘要:

Crystal Structure of Cpf1 in Complex with Guide RNA and Target DNA

Cpf1 is an RNA-guided endonuclease of a type V CRISPR-Cas system that has been recently harnessed for genome editing. Here, we report the crystal structure of Acidaminococcus sp. Cpf1 (AsCpf1) in complex with the guide RNA and its target DNA at 2.8 Å resolution. AsCpf1 adopts a bilobed architecture, with the RNA-DNA heteroduplex bound inside the central channel. The structural comparison of AsCpf1 with Cas9, a type II CRISPR-Cas nuclease, reveals both striking similarity and major differences, thereby explaining their distinct functionalities. AsCpf1 contains the RuvC domain and a putative novel nuclease domain, which are responsible for cleaving the non-target and target strands, respectively, and for jointly generating staggered DNA double-strand breaks. AsCpf1 recognizes the 5′-TTTN-3′ protospacer adjacent motif by base and shape readout mechanisms. Our findings provide mechanistic insights into RNA-guided DNA cleavage by Cpf1 and establish a framework for rational engineering of the CRISPR-Cpf1 toolbox.

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