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     CRISPR–Cas9工具使得科学家们能够几乎随意地改变基因组。人们称赞它比以往的技术明显更简单、更廉价及更通用，CRISPR–Cas9在全 球各地的实验室中大放光彩，已发现了一些医学和基础研究的新应用。但CRISPR–Cas9有其局限性。

      CRISPR是生命进化历史上，细菌和病毒进行斗争产生的免疫武器，简单说就是病毒能把自己的基因整合到细菌，利用细菌的细胞工具为自己的基因复制服 务，细菌为了将病毒的外来入侵基因清除，进化出CRISPR系统，利用这个系统，细菌可以不动声色地把病毒基因从自己的染色体上切除，这是细菌特有的免疫系统。

      加州大学圣地亚哥分校生物工程师Prashant Mali说，它擅长去到基因组的一个特定位点，在那里完成切割。“但有时候你感兴趣的应用要求还要多一点。”

     今年早些时候，一些研究人员怀着热情扑向了一种可能的新的基因编辑系统NgAgo，暴露了他们对CRISPR–Cas9不满的暗流，以及寻找替代方法的强烈动机。哈佛医学院遗传学家George Church说：“这暗示了每一种新技术是多么的脆弱。”

     NgAgo只是不断增长的基因编辑工具库中的一个工具。有一些是CRISPR的变体；另一些为编辑基因组提供了新途径。

     一个迷你版Cas9

     CRISPR–Cas9或有一天会被用来改写导致遗传疾病的一些基因。但这一系统的组件：Cas9酶和引导Cas9到达目的序列的一段RNA过大，无法填塞到基因治疗最常用病毒的基因组中，将外源遗传物质运送到人类细胞中。

     从葡萄球菌中取得的迷你Cas9形式是一种解决方案。它非常的小，可以硬塞进当前市场上基因治疗采用的病毒之中。去年12月，两个研究小组利用迷你版Cas9在小鼠中纠正了导致杜氏肌营养不良的基因。

     扩大范围

      Cas9不会到处进行切割——某一DNA序列必定存在于切割位点的附近。这一要求在许多基因组中很容易得到满足，但对于一些实验来说可能是一种令人痛苦的限制。研究人员正在寻找一些微生物提供有着不同序列要求的酶，这样他们可以扩大能够改造的序列数量。

      这样的一种酶Cpf1有可能成为一种有吸引力的替代。比Cas9要小，Cpf1有着不同的序列要求，且高度特异。

另一种叫做C2c2的酶，靶向的是RNA而非DNA——这一特征有潜力用于研究RNA及利用RNA基因组对抗病。

      真正的编辑器

      许多实验室只利用了CRISPR–Cas9来删除基因的一部分，由此破坏其功能。Church说：“人们想将这样的编辑宣布为胜利，但燃烧书的一页并不等于编辑了这本书。”

      那些想用一段序列交换另一段序列的研究人员面对着一个更艰难的任务。当Cas9切割DNA时，细胞往往会在缝合断裂端时生成一些错误——但这可以造成许多研究人员想要的缺失。

      想要改写一段DNA序列的研究人员依赖于可以插入一段新序列的一种不同的修复信号通路——发生这一过程的频率比容易出错的缝合要低得多。明尼苏达大 学植物科学家Daniel Voytas说：“每一个人都说，未来一次编辑多个基因，而我认为：‘我们现在甚至无法以高效率编辑一个基因。’”

      不过过去几个月里的一些进展给Voytas带来了希望。在今年4月，研究人员宣布他们让Cas9丧失功能，将它与可将一种DNA碱基转变为另一种 DNA碱基的酶连接在了一起。这一丧失能力的Cas9仍然靶向它的向导RNA指定的序列，但无法进行切割：转而连接的酶转变了DNA碱基，最终将此处的C 碱基转变成了T碱基。

       Voytas和其他研究人员希望连接其他使得Cas9丧失功能的酶将生成不同的序列改变。

      追逐Argonautes

      今年5一篇论文推出了一个全新的基因编辑系统。研究人员声称，他们能够利用一种叫做Argonaute的蛋白无需向导RNA 或一段特定的邻近基因组序列，可在预定位点切割DNA。转而他们采用了对应靶区域的一段短DNA序列编程了Argonaute蛋白。

       这一研究发现引发了关于CRISPR–Cas9将被夺位的一波兴奋与猜测，但一些实验室迄今为止无法重现这些结果。韩国首尔国立大学基因组工程师Jin-Soo Kim说，即便如此，来自其他细菌的argonautes仍有望提供一条前进的道路。

      编程一些酶

       另一些基因编辑系统也在准备中，尽管有些已在那徘徊多年。在一个广阔的细菌计划中，Church实验室并没有去触及CRISPR。转而，他的研究小 组依靠了一种叫做lambda Red的系统，无需向导RNA可以编程lambda Red来改造DNA序列。然而尽管Church实验室已开展了13年的研究，lambda Red还只能在细菌中起作用。

       Church和麻省理工学院与哈佛医学院Broad研究所的生物工程学家张锋（Feng Zhang）说，他们的实验室也正在致力开发整合酶和重组酶来用作为基因编辑器。张锋说：“通过利用酶的多样性，我们可以生成更强大的基因组编辑工具箱。 我们必须继续探索这些未知的事物。”

原文摘要：

Beyond CRISPR: A guide to the many other ways to edit a genome

The CRISPR–Cas9 tool enables scientists to alter genomes practically at will. Hailed as dramatically easier, cheaper and more versatile than previous technologies, it has blazed through labs around the world, finding new applications in medicine and basic research