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Nature子刊:液体活检技术的新进步

来源/作者:Guest   发表时间:2016-03-30 14:12:14  
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  循环肿瘤DNA(ctDNA)的高通量测序有望实现个性化的癌症治疗。不过,血液中的游离DNA(cfDNA)有限,限制了分析灵敏度。为此,斯坦福大学的研究人员近日开发出一种错误校正方法,能够检测到频率低至0.004%的突变等位基因。

       循环肿瘤DNA(ctDNA)的高通量测序有望实现个性化的癌症治疗。不过,血液中的游离DNA(cfDNA)有限,限制了分析灵敏度。为此,斯坦福大学的研究人员近日开发出一种错误校正方法,能够检测到频率低至0.004%的突变等位基因。

       在周一发表的《Nature Biotechnology》上,研究人员介绍了这种称为集成数字错误抑制(IDES)的方法。它是基于斯坦福团队之前开发的一种ctDNA检测技术,名为CAPP-seq,目前已被罗氏收购。

       之前,CAPP-seq技术的检测极限是0.02%,不过许多测序片段都有错误。为了解决这些错误,研究团队首先设计了一种分子条形码策略。许多ctDNA检测开发者也采用这种方案来降低错误率。单链DNA和双链DNA条形码策略都存在,不过都有缺点。双链DNA条形码在降低错误上更佳,但效率不及单链DNA条形码,因此不适合ctDNA量有限的样本。

       为此,他们着手设计出一种混合策略。首先,他们设计出测序接头,可用于单链和双链的分子条形码。双链分子的每条链上首先标记一个四碱基条形码,称为索引条形码。接着,他们在两条链的每个接头上添加两个二碱基条形码,称为插入条形码。在测序之后,互补的插入条形码可匹配,重新构建出原始的双链DNA分子。

       第二步,斯坦福的团队设计了一种计算工具,可以校正测序或PCR的系统错误。为了实现这一点,他们首先对12名健康成人的样本开展CAPP-seq检测。研究人员报告称,尽管所有种类的SNV都有背景错误,但最常见的是G→T的颠换,而C→T和G→A的错误也有。

       他们发现,G→T错误的出现是因为杂交捕获过程中的氧化损伤。他们利用一种计算方法来抑制这些错误。这两种策略的结合,使得错误率下降了15倍,这是通过30个健康对照样本和142个非小细胞肺癌样本证实的。

       研究人员也在NSCLS样本上验证了此检测。首先,他们检测了41名晚期NSCLS患者的EGFR热点突变。他们在88个血浆样本中检测到412个EGFR变异,所有变异都已经通过肿瘤活检样本确认。此外,这项检测未检出任何假阳性。

       接着,他们在参考细胞系上评估了检测的技术限制。他们创建了参考细胞系混合物,其中变异的等位基因的频率在0.05-1.6%。他们发现,条形码策略和计算校正方法是互补的,结合使用效果更佳。这种方法的理论检测极限是0.00025%。

       最后,他们利用这种方法来监控30名NSCLC患者中的突变,这些患者的肿瘤已经过基因分型。研究人员发现,他们能够检测到频率低至0.004%的突变。“据我们所知,这是到目前为止深度测序检测到的最少量ctDNA,”作者写道。

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