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       2016年3月15日，苏州大学基础医学与生物科学学院王晗课题组，在国际著名学术期刊《Scientific Reports》发表一项最新研究成果，题为“Targeted disruption of sp7 and myostatin with CRISPR-Cas9 results in severe bone defects and more muscular cells in common carp”。这项研究证明，TALEN和CRISPR-Cas9都是修改普通鲤鱼基因组的高度有效的工具，并为促进鲤鱼遗传学研究和育种，开辟了新的途径。

       本文通讯作者为苏州大学基础医学与生物科学学院博士生导师、特聘教授王晗，其本科毕业于安徽大学，获中科院硕士学位，美国韦恩州立大学博士学位，曾在美国佐治亚医学院、俄勒冈大学和俄克拉荷马大学从事博士后研究和助理教授，2009年至今，任苏州大学医学部基础医学与生物科学学院特聘教授、国家重大研究计划项目首席科学家。主要研究方向为生物钟分子遗传和基因组调控机制、生物钟对生殖和发育的影响、生物钟进化的分子遗传和基因组机制等领域，曾在Nature  Genetics、Development、Evolution和Journal of Molecular Evolution等杂志发表40余篇学术论文。

        在2014年12月份，王晗教授带领的课题组，利用TALEN技术，成功制备了两种斑马鱼per2无效突变体，阐明了Per2在斑马鱼生物钟中的基本功能，并为PER2在脊椎动物昼夜节律系统中的积极作用，提供了关键的证据，相关研究发表在《Journal of Biological Chemistry》杂志(苏州大学利用TALEN技术研究斑马鱼生物钟)。此后，相继有研究机构在斑马鱼中进行了CRISPR研究，例如：快速便宜的CRISPR/Cas9突变体筛选方法；用CRISPR实现斑马鱼高效基因敲入；用CRISPR/斑马鱼实现大规模基因打靶。

       普通鲤鱼（Cyprinus carpio）作为一种杂食的滤食性鱼，在100多个国家广泛养殖，其驯化品种锦鲤，因其鲜艳的花纹和图案，成为最受欢迎的户外观赏鱼。普通鲤鱼作为一种重要的水产养殖品种，通常体重超过3公斤，能够长到1米的长度。鲤鱼的年产量约为370万公吨，价值5.31亿美元。

       鲤鱼也是生态学、进化、环境毒理学、生理学、营养学、免疫学、发育学、育种和转基因研究的一种模式生物。虽然鲤鱼作为一种食物来源具有重要的经济价值，但它的肌间骨，使其在世界一些地区并不是一种美味佳肴。因此，为了提高其品质和经济价值，并且方便其作为生物模型的实用性，迫切需要对其进行遗传改良。然而，由于其相对较长的成熟期——约3至4年，较不频繁的产卵——每年只有一次，使得鲤鱼的遗传学研究和育种一直都是非常困难的。

        随着最近有关“普通鲤鱼基因组草图序列以及其他遗传和基因组资源”的报道出现（我国科学联合完成首个鲤鱼全基因组序列图谱），鲤鱼研究领域最迫切的需要是，对其开发基因组编辑工具。为此，该研究小组将TALEN和CRISPR技术应用于鲤鱼研究。TALEN和CRISPR-Cas9是两种设计的位点特异性基因组编辑系统，各自由一个DNA识别/结合部分和一个DNA裂解部分组成。

        在TALEN系统中，两个TALE结构域是DNA识别/结合部分，两个FokI结构域是DNA断裂部分，而在CRISPR-Cas9系统中，单导向RNA（gRNA）负责DNA识别/结合，Cas9内切酶用来切割DNA。一对TALENs或者一个具有Cas9蛋白的gRNA，可以引起位点特异性的DNA双链断裂（DSBs），这会诱导内源性非同源末端连接（NHEJ）的DNA修复途径，以在人体细胞和许多物种（包括大鼠、小鼠、斑马鱼、牛和植物）以及许多领域（如基础研究、临床治疗、农业和畜牧业）的靶基因中产生插入缺失突变。

       此外，CRISPR-Cas9具有操作容易、效率高和比TALEN成本低的优势，尤其是，CRISPR-Cas9可允许干细胞或受精卵中的多个基因诱变，并产生在F0代具有明显表型的双等位基因突变体，用于研究基因功能，而不用跨越几代对动物进行杂交。然而，到目前为止，这两种方法都没有被应用于鲤鱼研究。

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       在这项研究中，该研究小组采用TALEN和CRISPR-Cas9技术，来修改与骨形成有关的基因，如sp7基因——一个含有锌指的转录因子，在成骨细胞中表达，它能激活前成骨细胞分化为成熟的成骨细胞和骨细胞。此外，研究人员使用这两种技术，修改与骨形成相关的其他基因，包括runx2基因（runt相关转录因子2）——调节成骨细胞分化和骨发育的一个关键转录因子；spp1（分泌磷蛋白1）——参与骨矿化的一个后期成骨细胞特异性标记；opg（骨保护素）——参与影响破骨细胞形成的一个骨保护分子；和bmp2（编码骨形态发生蛋白2），从而促进runx2和sp7的表达，并诱导表达spp1、骨钙素等成骨基因的表达。

        该研究小组还使用这两种系统来修改mstnba——转化生长因子-β超家族的一个成员，以及骨骼肌生长的一个负调控因子。与野生型小鼠相比，Mstn基因敲除小鼠，在肌纤维的大小和肌细胞数量上显示出2到3倍的增加。

这些研究结果表明，mstnba-CRISPR和sp7a-CRISPR突变的鲤鱼，表现出肌肉或骨骼缺陷。研究人员还以很高的效率在鲤鱼中产生了mstnba; sp7a的双突变体。总之，这些结果表明，TALEN和CRISPR-Cas9系统，都是鲤鱼遗传学研究和育种的有效的基因组编辑工具。

        题目：Targeted disruption of sp7 and myostatin with CRISPR-Cas9 results in severe bone defects and more muscular cells in common carp
       原文摘要Abstract: The common carp (Cyprinus carpio) as one of the most important aquaculture fishes produces over 3 million metric tones annually, approximately 10% the annual production of the all farmed freshwater fish worldwide. However, the tetraploidy genome and long generation-time of the common carp have made its breeding and genetic studies extremely difficult. Here, TALEN and CRISPR-Cas9, two versatile genome-editing tools, are employed to target common carp bone-related genes sp7, runx2, bmp2a, spp1, opg, and muscle suppressor gene mstn. TALEN were shown to induce mutations in the target coding sites of sp7, runx2, spp1 and mstn. With CRISPR-Cas9, the two common carp sp7 genes, sp7a and sp7b, were mutated individually, all resulting in severe bone defects; while mstnba mutated fish have grown significantly more muscle cells. We also employed CRISPR-Cas9 to generate double mutant fish of sp7a;mstnba with high efficiencies in a single step. These results demonstrate that both TALEN and CRISPR-Cas9 are highly efficient tools for modifying the common carp genome, and open avenues for facilitating common carp genetic studies and breeding.